A PCR method to detect nocardia seriolae in fish samples
Yasuyuki miyoshi and satoru Suzuki（zt-1999@163.com）
Centerformarine environmental studies CMES, Ehime university
Matsuyama 790-8577, japan
摘要：我们设计了PCR的方法来检测鰤鱼诺卡氏菌16S rRNA基因。PCR的目标是Escherichia coli编号#609到1038序列，得到一段432bp的产物。这种方法可以诊断JCM3360菌株，以及从黄尾和日本比目鱼分离的八株菌株，但是另外的一些细菌，如5种其他的诺卡氏菌和四种其他的黄尾病原则无法检测到。PCR检测的极限是100CFU，一共有八条病鱼被用来检测。在所有的鱼当中都呈阳性反应。
Key word: nocardia seriolae, pcr, 16s RNA, seriola quinqueradiata
鱼类诺卡氏菌病首先在yellowtail鰤鱼和琥珀鱼中被发现。1967年在日本的Mie Prefecture Seriola dumerili中发现。当时诺卡氏菌病引起的病害并不严重，但是现在，损失有所增加。这是一种重新浮现的疾病。造成疾病的是鰤鱼诺卡氏菌（1998，kudo）。一种有分支的革兰氏阳性，抗酸的好氧放线菌。特点是表皮中出现囊中abscesses，在腮、肾、脾当中形成结节tubercles。因为这个结节形成了了一种对药物的障碍，所以化学药剂很难有效。所以快速检测就成为组织疾病泛滥的有效途径。标准的检测方法包括培养基挑选或者荧光抗体检测（FAT），但是鰤鱼诺卡氏菌需要四五天才能形成可见的菌落，而FAT则往往出现和其他细菌的交叉反映。所以我们需要建立一种及时有针对性的检测方法。
PCR检测目前在养殖鱼类中应用广泛了。1995年chun and goodfellow和其他一些研究人员决定了包括鰤鱼诺卡氏菌在内的16S rRNA序列。这些方法对于设计特异性引物很有用。在本研究中，我们采用PCR的方法来检测病鱼和鰤鱼诺卡氏菌。
材料和方法：
菌株和生长条件：
标准菌株是JCM3360鰤鱼诺卡氏菌。八株诊断菌株是从黄尾和日本比目鱼上分离的。黄尾分离菌株标号为EY01-1,EY01-2,EY01-3,EY01-4,EY015,EY01-6,EY01-7，比目鱼分离标号为KF01-1。使用五种诺卡氏菌。另外有若干其他细菌（……）。采用日本生产的小川25度培养四天或者十天。……。所有培养产物均放在四度冰箱内存放，直到进行DNA抽提。
从细菌中进行DNA抽提
1， 诺卡氏菌和分支杆菌的一个单菌落悬浮于500微升超纯水中，包含150微升InstaGene Matrix(Bio-Rad laboratories, USA)。
2， 将混合物震荡两分钟。
3， 100度加热三十分钟。
4， 9000g离心八分钟。
5， 将上清使用超纯水稀释五十倍，取5微升稀释液进行PCR分析。
6， 对于革兰氏阴性菌，一环的菌落稀释在（0.15M NaCl，0.1M EDTA，0.5mg/ml RNase A, 0.5% SDS），然后65度孵育5分钟。
7， 对于革兰氏阳性菌，一环的菌落溶解在100微升溶解液中（50微升/ml）。然后室温下孵育15分钟，然后加入分离液isolation solution。
8， DNA的纯化，通过包含TE缓冲液（10mM Tris-HCL ph8.0, 1mM EDTA）。 TE-saturated phenol: chloroform: iso-amylalcohol(25.24:1)（PCI）solution and then chloroform.
9， DNA通过酒精沉淀
10， 然后使用70%酒精洗
11， 干燥，然后溶解到50微升TE。Phenol
引物设计和PCR反应
16S rRNA是PCR的目的。上游引物NS1是专为鰤鱼诺卡氏菌设计的，，NG1是反向引物，是根据2000年laurent的报道设计的诺卡氏菌种的专用引物。
NS1: 5’-ACTCACAGCTCAACTGTGG-3’(tm 56.1°C，E.coli #609-627)
NG1:5’-ACCGACCACAAGGGGG-3’ (Tm 54.0°C，E.coli # 1023-1038)
The NS1 was based on the 16 S rDNA sequences of 17 Nocardia spp from the DDBJ/EMBL/GenBank database(Table 1) GENETIX-WIN(Version 5.1.1 sofeware development Co, ltd, Japan) software was used for genetic analysisi. NS1 was determined based on the matching of Tm to NG1 and the specific sequence for N.seriolae.
NS11-NG1之间对应的是E.coli的#609-1038之间的432bp的一段序列。
PCR反应条件：
1，50微升反应体系，PCR buffer(1mM Tris-Hcl(ph8.3),5mM KCl and 0.15mM MgCl2), 0.2mM dNTP mixture, 0.25微摩尔引物，25 U Ex-Taq poly-merase(TaKaRa, Japan)
2，denaturation
PCR检测的检测限度
使用50毫升聚丙烯管，将一环的诺卡氏菌JCM3360溶解于30mlBHI液体培养基。为了避免细胞集中，使用50颗3毫米直径的玻璃珠在摇床上摇动，25度4天。然后3500g离心20分钟。然后将沉淀溶解在PBS中，洗两次。最后重新溶解在20ml PBS当中。准备连续10倍的稀释，然后取每种稀释使用BHI培养基在25°C培养四天来确定每种稀释的可见细胞数量。另外一毫升的溶液用来抽提DNA。最大的PCR阳性反应稀释倍数就被认定为检测极限。
检测鰤鱼诺卡氏菌的临床样本
八株患诺卡氏菌或者细菌性溶血性贫血的黄尾样本被用来检测。样品是在2001年十月从从Ehime prefecture，或者是2002年11月Qita辖区采集的。DNA从各种组织中（脑，腮，心，肝，肾，脾，肌肉）中取得，肠道内容物和皮肤粘膜的采集方法采取2001年Qasem的方法，并进行轻微调整。
1，100mg样品粉末状分布于500微升的PBS中。
2，取其中100微升使用1微升的蛋白酶K（10mg/ml）在65度处理一小时。
3，然后加入900微升包含0.05% tween80的PBS缓冲液。
4，将混合物14000g离心10分钟。
5，将上清倒掉。
6，然后将含有DNA的沉淀溶解于100微升TES。
TES配方：5微升20%SDS，2微升蛋白酶K；50mM Tris-HCl(ph8.0)；5mM EDTA, 50mM NaCl。
7，65度孵育一小时。
8，然后使用等体积PCI将抽提的DNA连续分离两次。
9，DNA的沉淀采用两倍体积的纯酒精在-20°C冰箱中过夜沉淀。
10，使用70%酒精洗。
11，干燥后将DNA溶解在40微升超纯水中。取3微升进行PCR。
12，各种器官都采用同样方法。
结果和讨论
在床边贴一张纸，有日期，然后在日期后是用黑色记号笔写得一个个“正”字。刚开始的时候，每一画就代表十个床沿俯卧撑。
